非蛋白質巰基含量檢測試劑盒說明書-可見分光光度法

非蛋白質巰基含量檢測試劑盒說明書   可見分光光度法
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
規(guī)格：50T/24S
產品內容：
提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5mL 無水甲醇充分溶解備用。
標準品：粉劑×1 支，10mg半胱氨酸，4℃保存。臨用前加入 1.65mL 提取液溶解為 50μmol/ml 的半胱氨酸標準溶液。
提取液的配制：將提取液一和提取液二按體積比 1：1 的比例混合配制，按照樣本數量配制并在當天用完。
產品說明：
生物體內巰基主要包括非蛋白質巰基和蛋白質巰基。巰基化合物在體內具有重要的解毒功能， 對生物體的自我調節(jié)具有非常重要的生理意義。
巰基基團與 5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在 412nm 處有最大吸收峰。
自備實驗用品：
可見分光光度計、離心機、恒溫水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、甲醇、研缽/勻漿器和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣品的制備
1、 動物、植物組織：稱取約 0.1g，加入 1mL 的提取液，制備成 10%的勻漿，10000g，常溫離心
10min，取上清待測。
2、   細胞：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL  提取液），超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
3、   血清（漿），培養(yǎng)液：向 0.1mL 血清（漿）或培養(yǎng)液中加入 1mL 提取液，10000g，常溫離心10min，取上清待測。
二、測定步驟
1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調零。
2、將 50μmol/mL 標準溶液用提取液稀釋至 0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL 的標準液，現用現配。
3、操作表
 
對照管
測定管
標準管
空白管
上清液（mL）
0.3
0.3
-
-
標準品（mL）
-
-
0.3
-
試劑一（mL）
0.65
0.65
0.65
0.65
試劑二（mL）
-
0.1
0.1
-
H2O（mL）
0.1
 
 
0.4
混勻，室溫放置 10min，測定 412nm 吸光值，分別記為 A 對照、A 測定、
A 標準、A 空白，計算?A 測定=A 測定-A 對照，算?A 標準=A 標準-A 空白。
三、計算公式
1、 標準曲線的繪制：
以標準液濃度為 x 軸，?A 標準為 y 軸，繪制標準曲線，得到標準方程 y=kx+b，將?A 測定代入公式得到 x（μmol/mL）
2、 非蛋白質巰基含量計算：
（1） 按樣本鮮重計算：
非蛋白質巰基含量（μmol/g 鮮重）=x×V 提取÷W=x÷W
（2） 按血清、培養(yǎng)液體積計算：
非蛋白質巰基含量（μmol/mL）=x×（V 提取+V 液體）÷V 液體=1.1×x。
（3） 按細胞數量計算：
非蛋白質巰基含量（μmol/104 cell）=x×V 提取÷500=0.002×x。
V 提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；W：樣品質量，g；Cpr，樣本蛋白濃度，mg/ml；500：500 萬個細胞；V 液體：血清（漿）或培養(yǎng)液體積，0.1mL。
注意事項：
1、當吸光值大于 1.2 時，建議將上清液用提取液稀釋后測定；吸光值過小時，建議提高樣品質量或體積進行測定。