外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質(zhì)內(nèi)容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質(zhì)、周質(zhì)蛋白、黏附素、免疫調(diào)節(jié)化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細(xì)胞外間隔體，雙層磷脂，20 至 200 納米大小，來自于革蘭氏陰性細(xì)菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產(chǎn)物，使之與環(huán)境或宿主細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，并調(diào)解各種功能，包括促進(jìn)病理形成，調(diào)節(jié)細(xì)菌互動(dòng)，轉(zhuǎn)運(yùn)各種信號分子（例如 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、毒力因子等），保護(hù)細(xì)菌生存、結(jié)合和侵入，引起毒性，產(chǎn)生抗生素抗性等。外膜囊泡的產(chǎn)量取決于細(xì)菌生長周期、營養(yǎng)條件、溫度、氧化應(yīng)激狀態(tài)等。病原菌的外膜囊泡 10 倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發(fā)中免疫調(diào)節(jié)潛力。通過差速離心和蛋白酶抑制混合劑，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

HEPENGBIO 保存液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 溶解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 活性液（Reagent C） 微升
產(chǎn)品說明書 1 份

保存方式

保存 HEPENGBIO 活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保證 6 月

用戶自備

50 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器分光光度儀：用于測定細(xì)菌濃度
臺式離心機(jī)：用于樣品操作 超速離心機(jī)：用于樣品操作 恒溫?fù)u床：用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞
0.45 微米濾膜：用于樣品操作真空濃縮裝置：用于樣品操作

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的 HEPENGBIO 活性液（Reagent C）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融， 然后移出xx 毫升 HEPENGBIO 溶解液（Reagent B）到 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 HEPENGBIO 活性液（Reagent C），充分混勻，置于冰槽里，標(biāo)記為 HEPENGBIO 溶解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1.準(zhǔn)備好 1 毫升過夜培養(yǎng)的新鮮細(xì)菌樣品
2.移取 500 微升到 50 毫升細(xì)菌培養(yǎng)液（注意：用戶可以進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，例如無鐵培養(yǎng)等）
3.放進(jìn) 37℃恒溫?fù)u床孵育過夜，速度為 200RPM
4.在分光光度儀上測 OD600 為 1（1 OD＝1 X 109 細(xì)胞/毫升；總量為 5 X 1010 細(xì)胞）
5.轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 50 毫升錐形離心管
6.放進(jìn) 4℃臺式離心機(jī)離心 30 分鐘，速度為 5000g
7.小心移取上清液到新的 50 毫升錐形離心管
8.重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 6 和 7 一次
9.使用 0.45 微米濾膜真空過濾一次
10．（選擇步驟）使用 100kD 蛋白臨界點(diǎn)濃縮處理
11.放進(jìn) 4℃超速離心機(jī)離心 3 小時(shí)，速度為 150000g
12.小心抽去上清液
13.加入 xx 微升預(yù)冷的 HEPENGBIO 保存液（Reagent A）
14.或加入 xx 微升預(yù)冷的含有 HEPENGBIO 溶解液（Reagent B）和 HEPENGBIO 活性液（Reagent C） 的 HEPENGBIO 溶解工作液
15.用槍頭上下抽吸，充分混勻
16.轉(zhuǎn)移到到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管
17.即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里備用
18.進(jìn)行后續(xù)蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等

注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品為 20 次（50 毫升菌液）操作
2.所有操作須在 4℃狀態(tài)下進(jìn)行
3.建議使用新鮮細(xì)菌接種，培養(yǎng)到指數(shù)生長階段為理想狀態(tài)
4.HEPENGBIO 活性液（Reagent C）避免反復(fù)凍融
5.本產(chǎn)品按照 50 毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應(yīng)調(diào)整試劑用量
6.根據(jù)菌種不同，50 毫升（OD600＝1）菌液可獲得 5 至 100 微克外膜囊泡蛋白
7.制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆茫瑖?yán)格避免反復(fù)凍融