鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。Fluo-4，一種與鈣離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)100倍的熒光探針，可以敏感測(cè)定微量游離鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm，來(lái)定量測(cè)定組織細(xì)胞的鈣濃度。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）      毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）      毫升
HEPENGBIO飽和液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）      毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
 
用戶(hù)自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
DOUNCE勻漿器：用于樣品制備
超聲儀：用于樣品制備
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
黑色96孔板：用于樣品熒光測(cè)定的容器
熒光酶標(biāo)儀：用于樣品熒光分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入預(yù)冷的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）
12． （或超聲處理：100瓦，10秒一次，間隔1分鐘，重復(fù)3次）
13． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管
14． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
15． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
16． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
17． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
18． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品，置于冰槽里備用
2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)485nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm
 
三、熒光測(cè)定
 
1． 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，標(biāo)記為：樣品孔、空白對(duì)照孔、最大對(duì)照空
2． 移取100微升（20微克蛋白）上述制備的樣品到樣品孔里
3． 移取xx微升HEPENGBIO飽和液（Reagent D）到最大對(duì)照空里
4． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）到空白對(duì)照空
5． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里
6． 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板，混勻
7． 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
8． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：獲得相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
9． 計(jì)算樣品鈣離子濃度：納摩爾（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）