線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導(dǎo)致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內(nèi)容物釋放。其中鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內(nèi)熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent B） 微升
HEPENGBIO稀釋液（Reagent C） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
 
用戶自備
 
24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器
1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器
微型臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析
熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析
細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為HEPENGBIO染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、 貼壁細(xì)胞染色
 
1． 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的預(yù)處理后待測細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項8）
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 小心抽去清理液
5． 小心沿著孔壁加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
6． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
7． 小心抽去HEPENGBIO染色工作液
8． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
9． 小心抽去清理液
10． 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
11． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)
 
（B） 使用熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：
放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)
 
二、 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色
 
1． 將預(yù)處理后懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管
2． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
3． 小心抽去上清液
4． 加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
5． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
6． 小心抽去上清液
7． 加入xx微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent B）和HEPENGBIO稀釋液（Reagent C）的HEPENGBIO染色工作液，充分混勻 
8． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
9． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心抽去上清液
11． 加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
12． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心抽去上清液
14． 加入xx微升37℃預(yù)熱的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
15． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
a) 進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：激發(fā)波長488nm氬離子激光，散發(fā)波長570nm（FL2），觀察10000個細(xì)胞以上――
波峰左移，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)
 
b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 
2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
綠色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)
 
c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：
1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯
2）加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――
RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)