色氨酸羥化酶 （Tryptophan Hydroxylase；TPH；EC1.14.16.4），又稱為色氨酸單加氧酶（Tryptophan 5-monooxygenase）是芳香族氨基酸羥化酶家屬中的成員，通過(guò)將羥基基團(tuán)加在色氨酸的5’位上，產(chǎn)生5-羥色胺酸（5-hydroxytryptophan；5-HTP），成為神經(jīng)傳遞介質(zhì)5-羥色胺（serotonin）的前體。色氨酸羥化酶分為2個(gè)亞型：TPH1和TPH2。前者在外周末梢和中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)，例如皮膚、內(nèi)臟、松果體，后者只在神經(jīng)元上高度表達(dá)。其活性異常將導(dǎo)致與5-羥色胺生成信號(hào)通路（serotonergic pathway）有關(guān)的精神疾病，包括抑郁、精神分裂、強(qiáng)迫癥、自殺行為等的病理演變?；诘孜锷彼岷退臍渖锏剩╰etrahydrobiopterin）在色氨酸羥化酶的催化下，產(chǎn)生5-羥色胺酸和二氫生物蝶呤（dihydrobiopterin），進(jìn)而使用福林-喬卡爾泰烏酚試劑 （Folin -Ciocalteu phenol reagent），在堿性條件下，與5-羥色氨酸反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物，在分光光度儀下（736nm波長(zhǎng)）檢測(cè)，來(lái)定量分析色氨酸羥化酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO顯色液（Reagent E）   毫升
HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent F）   毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G）   毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份
 
 
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照；有效6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于脫離細(xì)胞
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約40下） 
12． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
13． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
14． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
16． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
17． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀：波長(zhǎng)756nm，并置零 
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent E）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對(duì)照測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照讀數(shù)
 
四、 樣品測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入10微升待測(cè)樣品（150微克蛋白），混勻
4． 在37℃溫度下孵育15分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
6． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent E）
7． 加入xx微升HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在37℃溫度下孵育60分鐘
10． 轉(zhuǎn)移到1毫升比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)
 
五、 計(jì)算樣品活性
 
 
注意事項(xiàng)
 
1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
4． 建議使用比色皿測(cè)定
5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 
6． 測(cè)定值由低到高變化；孵育反應(yīng)可持續(xù)15分鐘
7． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
8． 樣本測(cè)定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
9． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為150微克/10微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
10． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
11． 色氨酸羥化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾5-羥色氨酸（5-HTP）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
12． 本公司提供系列羥化酶酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品