磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC2.7.1.11），又稱為環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鳥(niǎo)苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通過(guò)水解環(huán)核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯鍵（phosphodiester bond）產(chǎn)生5’-核苷（5’-nucleotides），使環(huán)核苷酸失活，達(dá)到調(diào)控第二信使分子環(huán)核苷酸的水平。其中環(huán)腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命體細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，以調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、炎癥、蛋白磷酸化、基因轉(zhuǎn)錄等各種功能?；诎被嵝蛄?、底物特異性、調(diào)節(jié)特征、組織分布和藥理特性等，磷酸二酯酶家屬分為11種亞酶，例如PDE4/7/8是cAMP為底物；PDE5/6/9是cGMP為底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP為底物等，具有不同的生化特性、組織表達(dá)特異性和通路特征。 磷酸二酯酶5是主要的cGMP代謝性酶，存在于體內(nèi)平滑肌組織細(xì)胞里。參與cGMP的信號(hào)傳導(dǎo)和Corpus cavernosum以及血管平滑肌作用。PDE5抑制劑常用于治療勃起障礙和肺動(dòng)脈性高血壓等?；诘孜锃h(huán)核苷酸，在磷酸二酯酶5敏感性抑制劑 （MY-5445 [1-(3-Chlorophenylamino)-4-phenylphthalazine]）存在的情況下，通過(guò)磷酸二酯酶5的催化作用，產(chǎn)生1-磷酸鳥(niǎo)苷產(chǎn)物后，經(jīng)由5-核苷酸酶（5-nucleotidase；5-NT）作用，釋放出游離磷酸根，進(jìn)而與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應(yīng)后，通過(guò)分光光度儀（660nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析磷酸二酯酶5的特異活性。磷酸二酯酶5酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E）   微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F）   微升
HEPENGBIO終止液（Reagent G）   毫升
HEPENGBIO顯色液（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I） 微升
HEPENGBIO專性液（Reagent J） 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO酶促液（Reagent D）、HEPENGBIO底物液（Reagent E）、HEPENGBIO顯色液（Reagent H）、HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）和HEPENGBIO專性液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照，有效6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、 樣品準(zhǔn)備
 
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 
9． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
10． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
11． 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
12． 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)660nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO顯色液（Reagent H）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
 
1． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
2． 按下表分別加入HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）和HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到每個(gè)離心管，混勻
3． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表
 

管號(hào)	HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）	HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）	標(biāo)準(zhǔn)5-GMP濃度
1	0	xx微升	xx微摩爾/升
2	xx微升	xx微升1號(hào)管	xx微摩爾/升
3	xx微升	xx微升2號(hào)管	xx微摩爾/升
4	xx微升	xx微升3號(hào)管	xx微摩爾/升
5	xx微升	0	0

 
4． 加入40微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
5． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
6． 在30℃溫度下孵育30分鐘
7． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
8． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
9． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
10． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
12． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟4至11四次
13． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)5-GMP濃度（微摩爾/升）
 
四、 樣品背景測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入5微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 上下傾倒數(shù)次，混勻
4． 在30℃溫度下孵育30分鐘
5． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
6． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
7． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
8． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景讀數(shù)
10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)5-GMP濃度（微摩爾/升）
 
五、 樣品總活性測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入5微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻
8． 在30℃溫度下孵育30分鐘
9． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
10． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
11． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
12． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
13． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù) 
14． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)5-GMP濃度（微摩爾/升）
 
五、樣品非特異活性測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent J）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入5微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻
9． 在30℃溫度下孵育30分鐘
10． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
11． 加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G），混勻
12． 加入xx微升HEPENGBIO顯色液（Reagent H），混勻
13． 室溫下靜置15分鐘，避免光照
14． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)
15． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)5-GMP濃度（微摩爾/升）
 
六、計(jì)算樣品活性
 
（1） 樣品總活性和非特異活性計(jì)算
 
 
（2） 樣品特異活性計(jì)算
 
 
注意事項(xiàng)
 
1． 本產(chǎn)品為20次（10個(gè)樣本）操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定只需1次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 樣品中避免使用EDTA、EGTA、磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理等
6． HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent H）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
7． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
8． 如果用戶沒(méi)有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代
9． 顯示綠色表明具有較強(qiáng)酶活性
10． 測(cè)定值由低到高變化
11． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
12． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
13． 磷酸二酯酶5單位活性定義為：在30℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1納摩爾環(huán)核苷酸（cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
14． 本公司提供系列磷酸二酯酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品