.jpg.jpg)
線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的方法基本上采用：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（HPBIO12028）或PBS緩沖溶液（HPBIO12033）：用于清理細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于細(xì)胞脫離
完全細(xì)胞培養(yǎng)液（HPBIO12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞或組織收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 動(dòng)物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
12． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
13． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
15． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
17． （選擇步驟）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
19． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
二、動(dòng)物軟組織線粒體分離（化學(xué)處理法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放入液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
11． 加入500微升預(yù)冷的HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D）
12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
15． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
16． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
17． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
19． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
21． （選擇步驟）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
23． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
三、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（細(xì)胞勻漿法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
12． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
16． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
17． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
18． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
20． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
21． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
23． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
25． （選擇步驟）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
27． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
四、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（化學(xué)處理法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
17． 加入500微升預(yù)冷的HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D）
18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
20． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
21． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
22． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
25． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
27． （選擇步驟）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
29． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（HPBIO12028）或PBS緩沖溶液（HPBIO12033）：用于清理細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于細(xì)胞脫離
完全細(xì)胞培養(yǎng)液（HPBIO12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞或組織收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分
DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 動(dòng)物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
12． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
13． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
15． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
17． （選擇步驟）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
19． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
二、動(dòng)物軟組織線粒體分離（化學(xué)處理法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放入液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
11． 加入500微升預(yù)冷的HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D）
12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
15． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
16． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
17． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
19． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
21． （選擇步驟）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
23． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
三、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（細(xì)胞勻漿法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
12． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
16． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
17． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
18． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
20． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
21． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
23． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
25． （選擇步驟）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
27． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
四、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（化學(xué)處理法）
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
17． 加入500微升預(yù)冷的HEPENGBIO強(qiáng)化液（Reagent D）
18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
20． 加入5毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
21． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
22． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
25． （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
27． （選擇步驟）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
29． 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里
