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凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），又稱為活化因子IIa（Activated Factor Iia），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液循環(huán)中的凝血蛋白。其原酶分子量是72kd，由活化因子Xa（Activated Factor Xa）所切離產(chǎn)生的活化凝血酶分子量是36kd。其功能在于將血漿中可溶性纖維蛋白原（fibrinogen）轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白凝塊（fibrin clot），活化因子XI、V、VIII，XIII等，以及促進(jìn)血小板聚集等凝血機(jī)制方面發(fā)揮重要作用。凝血酶影響一系列正常和病理反應(yīng)，包括炎癥、組織修復(fù)、胚胎形成、血管形成、腫瘤浸潤等。凝血酶基因突變將導(dǎo)致血栓形成（thrombosis）。凝血酶的目標(biāo)蛋白切離部位為Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。尿激酶的抑制劑是苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride；PMSF）?；谌斯ず铣傻亩嚯幕衔锏孜颒-D-Phe-Pip- Arg-pNA（HD-苯丙氨酰- pipecolyl-精氨酰對硝基苯胺）受到凝血酶的水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定凝血酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent C） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent C）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測定的容器
酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品制備
1． 準(zhǔn)備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
5． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
6． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
二、 測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品
2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
3． 實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
三、 活性測定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent B）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板（注意：避免氣泡）
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
8． 活性計(jì)算：
（1） 酶標(biāo)儀檢測
（2） 比色皿檢測
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
5． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘
6． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
7． 樣本測定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HEPENGBIO30030.1）
9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
10． 可以使用凝血酶抑制劑，N-α-NAPAP，作為抑制劑對照或陰性對照
11． 凝血酶單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷或其他用途。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent C） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent C）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
酶標(biāo)板或比色皿：用于樣品比色測定的容器
酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品制備
1． 準(zhǔn)備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
5． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
6． 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存
二、 測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品
2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
3． 實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
三、 活性測定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent B）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板（注意：避免氣泡）
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
8． 活性計(jì)算：
（1） 酶標(biāo)儀檢測
（2） 比色皿檢測
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
5． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)60分鐘
6． 比色測定后，比色皿須清洗徹底
7． 樣本測定60分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HEPENGBIO30030.1）
9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
10． 可以使用凝血酶抑制劑，N-α-NAPAP，作為抑制劑對照或陰性對照
11． 凝血酶單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷或其他用途。
