糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負電荷性長鏈多聚糖，由重復的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細胞膜和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發(fā)生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發(fā)揮各種不同的作用，包括酶的調(diào)節(jié)、細胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應?；谔前范嗵堑母叨蓉撾姾傻奶攸c，使用異染性（metachromatic）陽離子藍色染料二甲基亞甲基藍（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結(jié)合產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測定，來定量分析糖胺多糖的總含量。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）         120毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent B）        20 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）   25 毫升
HEPENGBIO解離液（Reagent D）   25 毫升
HEPENGBIO標準液（Reagent E）    100微升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent C）避免光照；有效保證3月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應
微型臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
 
實驗步驟
 
一、樣品預處理  
 
1． 準備好75cm²細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁷細胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B）
10． 放進一個1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻
12． 放進56℃恒溫水槽孵育16小時
13． 放進90℃恒溫水槽孵育10分鐘
14． 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
16． 置于冰槽里備用
 
二、標準樣品配制
 
1． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
2． 分別加入50微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1至5號管
3． 移取50微升HEPENGBIO標準液（Reagent E）到1號管，混勻
4． 小心移取50微升1號管稀釋的HEPENGBIO標準液（Reagent E）到2號管，混勻
5． 小心移取50微升2號管稀釋的HEPENGBIO標準液（Reagent E）到3號管，混勻
6． 小心移取50微升3號管稀釋的HEPENGBIO標準液（Reagent E）到4號管，混勻
7． 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表
 

管號	HEPENGBIO清理液（Reagent A）	HEPENGBIO標準液（Reagent E）	標準糖胺多糖含量
1	50微升	50微升	5微克
2	50微升	50微升1號管	2.5微克
3	50微升	50微升2號管	1.25微克
4	50微升	50微升3號管	0.625微克
5	50微升	0	0

 
 
三、 標準曲線測定
 
1． 移取50微升上述配制的HEPENGBIO標準液（Reagent E）到1.5毫升離心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒
5． 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得標準樣品吸光讀數(shù)
12． 重復實驗步驟1至11四次
13． 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標（X軸）為標準糖胺多糖含量（微克）
 
四、 樣品測定
 
1． 加入50微升上述制備的待測樣品到1.5毫升離心管
2． 加入1毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒
5． 即刻放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
7． 加入1毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)
12． 根據(jù)上述標準曲線獲得樣品對應糖胺多糖含量（微克）
 
五、 濃度計算
根據(jù)上述標準曲線樣品對應糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）=微克糖胺多糖/毫升