肌動蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構成細胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細肌絲（thin filament），以及細胞膜表面?zhèn)巫悖╬seudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動蛋白存在于所有真核生物細胞中，且高度進化保留，參與各種重要細胞功能，包括細胞遷移、細胞分裂、肌肉收縮、細胞形態(tài)維護、膜轉運（membrane trafficking） 等。哺乳動物具有六種異構體，分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白（G-actin）在生理條件下，組合成長絲聚合體，轉化為絲狀肌動蛋白（F-actin），形成細胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態(tài)學變化是細胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數之一。鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種由毒性菇類中分離的二環(huán)七肽（bicyclic heptapeptide）生物堿，與聚合的微絲（F-肌動蛋白）結合，因此通過異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鬼筆環(huán)肽可以體外探測細胞F-肌動蛋白的分布和含量，據此分析細胞骨架裝配的調控機制。
 
產品內容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）        毫升
HEPENGBIO固著液（Reagent B）        毫升
HEPENGBIO通透液（Reagent C）        毫升
HEPENGBIO封阻液（Reagent D）        毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent E）      微升
HEPENGBIO復染液（Reagent F）       微升
產品說明書   1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO染色液（Reagent E）和HEPENGBIO復染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HEPENGBIO12024）：用于細胞脫離
完全細胞培養(yǎng)液（HEPENGBIO12052）：用于中和胰蛋白酶的處理
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細胞熒光觀察
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升HEPENGBIO通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent E）和HEPENGBIO復染液（Reagent F），混勻后，標記為HEPENGBIO染色工作液，置于冰槽里，放進暗室里備用。然后進行下列操作。
 
一、 直接法
 
1． 準備1個細胞培養(yǎng)6孔板，內置1個細胞1 X 1 cm大小的載玻片
2． 接種待測細胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達70％ 
3． 小心抽去細胞培養(yǎng)液
4． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
5． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent A）
6． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO固著液（Reagent B）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
7． 置于冰槽里孵育30分鐘
8． 小心抽去HEPENGBIO固著液（Reagent B）
9． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO通透液（Reagent C）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
10． 小心抽去HEPENGBIO通透液（Reagent C）
11． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO封阻液（Reagent D）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
12． 室溫下孵育30分鐘
13． 小心抽去HEPENGBIO封阻液（Reagent D）
14． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
15． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent A）
16． 重復實驗步驟14和15一次
17． 小心加上xx微升HEPENGBIO染色工作液， 覆蓋樣品表面
18． 在暗室里室溫下孵育60分鐘
19． 小心抽去HEPENGBIO染色工作液
20． 輕輕加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
21． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent A）
22． 封片
23． 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數200個細胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm（F－肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細胞核染色）――
綠色熒光顯示F-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀
 
二、 間接法
 
1． 準備1個25cm²細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞，直至鋪滿率達70％（約100萬細胞數）
2． 小心移出細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）
3． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面
4． 小心移出xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管 
5． 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細胞表面
6． 放進37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
7． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
8． 加入3毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
9． 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞可以由此步開始）
10． 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
11． 小心抽去上清液
12． 加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻
13． 轉入到1.5毫升離心管
14． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15． 小心抽去上清液
16． 加入xx微升HEPENGBIO固著液（Reagent B），混勻
17． 置于冰槽里孵育30分鐘
18． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19． 小心抽去上清液
20． 加入xx微升HEPENGBIO通透液（Reagent C），混勻
21． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
22． 小心抽去上清液
23． 加入xx微升HEPENGBIO封阻液（Reagent D），混勻
24． 室溫下孵育30分鐘
25． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
26． 小心抽去上清液
27． 加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻
28． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
29． 小心抽去上清液
30． 加入xx微升HEPENGBIO染色工作液
31． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群
32． 在暗室里室溫下孵育60分鐘 
33． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
34． 小心抽去上清液
35． 加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻
36． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
37． 小心抽去上清液
38． 加入200微升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻
39． 即刻移取10微升在載玻片上壓片
40． 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數200個細胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm（F-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細胞核染色）――
綠色熒光顯示F-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀射