果糖1,6-二磷酸酶（fructose 1, 6-diphosphatase；FBPase；EC3.1.3.11），全稱為果糖1,6-二磷酸1-磷酸水解酶（D-fructose-1,6-bisphosphate 1-phosphatehydrolase），為合成代謝（糖異生和Calvin循環(huán)）通路中的限速酶質(zhì)之一，催化果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸的去磷酸化反應(yīng)，金屬離子鎂和錳必需。其分為5類，其中IV和V類在古生菌（archaea）和細菌中存在。哺乳動物果糖1,6-二磷酸酶分成2個亞型：I型（肝型）和II型（肌肉型）。在動物肝臟和腎臟組織中高度表達，參與糖異生調(diào)節(jié)；植物分成2個亞型：胞漿型和葉綠體型。葉綠體型為光依賴性活化，參與光合成碳還原循環(huán)，對于AMP抑制不敏感，而胞漿型參與糖異生調(diào)節(jié)。果糖1,6-二磷酸酶成為潛在的藥物靶標，抑制內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生。基于底物果糖1,6-二磷酸（D-fructose- 1,6-bisphosphate），在果糖1,6-二磷酸酶的催化下，分解并產(chǎn)生果糖-6磷酸（D-frucose-6-Phosphate）產(chǎn)物后，通過磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（Phosphoglucose isomerase；PGI）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH）反應(yīng)系統(tǒng)，測定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）所產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm 波長），來定量分析糖原磷酸化酶的總活性。其連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
      
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）  毫升
HEPENGBIO底色液（Reagent D）  毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）    毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F）    微升
產(chǎn)品說明書     1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）、HEPENGBIO底色液（Reagent D）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里，HEPENGBIO底色液（Reagent D）和HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于光度分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準備
 
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入適量的（xx毫克組織需要xx毫升）HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入置于冰槽里的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管 
10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
12． 即刻放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g （或13000RPM。例如EPPENDORF 5415）
13． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
15． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
 
二、 測定準備
 
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底色液（Reagent D）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent D）
4． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）
 
四、 樣品測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入20微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為6.8）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 
 
五、 計算樣品活性
 
 
六、 酶標儀測定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到所有孔里
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO底色液（Reagent D）到所有孔里
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）到所有孔里
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）或待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為6.8）到相應(yīng)孔里
8． 輕輕搖動96孔板
9． 即刻放進酶標儀檢測，包括0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
10． 活性計算