5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進(jìn)化保留的激酶復(fù)合物，由3個(gè)亞體，α、β、γ構(gòu)成：其中γ亞體有4個(gè)胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結(jié)構(gòu)域，又稱為巴特曼（Bateman）結(jié)構(gòu)域，以探測(cè)AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結(jié)構(gòu)域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 復(fù)合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構(gòu)體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持細(xì)胞能量?jī)?nèi)環(huán)境恒定：促進(jìn)脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進(jìn)肌肉葡萄糖吸收和調(diào)節(jié)胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達(dá)。其磷酸化目標(biāo)序列為 LKKLTRASFFGQ。基于底物L(fēng)KKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反應(yīng)方式為：
AMPK
LKKLTRASFFGQ  +  ATP  →  LKKLTRApSFFGQ  +  ADP
 
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP
         
lactate dehydrogenase
pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺
           （高吸收峰） （低吸收峰） 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）   10毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）    4毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D）  500微升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）  500微升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  500微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G）  500微升
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
 
用戶自備
 
AMPK激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻（注意：可以調(diào)節(jié)蛋白濃度）
10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對(duì)照測(cè)定
 
1． 移取130微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
 
四、 樣品測(cè)定
 
1． 移取130微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入10微升待測(cè)樣品（注意：100微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
 
五、 計(jì)算樣品活性
 
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.2（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
 
單位＝微摩爾NADH/分鐘
 
六、 酶標(biāo)儀測(cè)定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取130微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
4． 分別加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
5． 分別加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
6． 輕輕搖動(dòng)96孔板
7． 在30℃溫度下孵育3分鐘
8． 分別加入10微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（100微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
9． 輕輕搖動(dòng)96孔板
10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
11． 活性計(jì)算：
 
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.2（體系容量；毫升）]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
 
單位＝微摩爾NADH/分鐘
 
七、抑制劑篩選
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品
2． 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理
 

內(nèi)容物	空背景對(duì)照	樣本背景	完全酶活性	待測(cè)抑制劑酶活性
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）	20微升	20微升	20微升	20微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G）	20微升	10微升	10微升	——
待測(cè)抑制劑	——	10微升	――	10微升
用戶自備的純化酶	——	——	10微升（1毫單位）	10微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對(duì)照孔 （40微升）	樣本背景孔 （40微升）	完全活性孔 （40微升）	待測(cè)抑制劑樣品孔 （40微升）
輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 
3． 分別移取100微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分別加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
5． 分別加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
6． 分別加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
7． 輕輕搖動(dòng)96孔板
8． 在30℃溫度下孵育3分鐘
9． 加入40微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
10． 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀0分鐘和30分鐘
11． 實(shí)際讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)—30分鐘讀數(shù)
12． 抑制活性計(jì)算：
1) [（完全活性讀數(shù)－空背景對(duì)照讀數(shù)）－（抑制劑樣品活性讀數(shù)－樣本背景讀數(shù)）]÷（完全活性讀數(shù)－空背景對(duì)照讀數(shù)）＝實(shí)際抑制百分率
2) IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度
X（所需抑制劑樣品濃度）＝（已知抑制劑樣品濃度÷實(shí)際抑制百分率）X 50％
i. 直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD）；橫座標(biāo)（X軸）為已知抑制劑濃度