內(nèi)吞體（endosome）為功能上、形態(tài)上、生化結(jié)構(gòu)上非均質(zhì)性（heterogenous）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器組分，其功能在于將配體、受體、膜內(nèi)容物進(jìn)行歸類整理。 內(nèi)吞體的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得內(nèi)吞體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內(nèi)吞體。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）   毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）   毫升
HEPENGBIO高密液（Reagent C）   毫升
HEPENGBIO中密液（Reagent D）   毫升
HEPENGBIO低密液（Reagent E）   毫升
產(chǎn)品說明書   1份
 
保存方式
 
保存在4℃冰箱里，有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
6毫升和14毫升超速離心管：用于超高速離心的容器
4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備
DOUNCE勻漿器：用于裂解（組織）細(xì)胞
 
 
 
 
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
一、 組織樣品處理
 
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，避免或去除脂肪組織，秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)7）
10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3800g
12． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
13． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為4300g
14． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
15． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為30000g
16． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
17． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為285000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)吞體組分
19． 加入5毫升HEPENGBIO高密液（Reagent C），充分混勻沉淀物
20． 轉(zhuǎn)移到14毫升超速離心管
21． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO中密液（Reagent D）在HEPENGBIO高密液（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
22． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO低密液（Reagent E）在HEPENGBIO中密液（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
23． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）在HEPENGBIO低密液（Reagent E）的上面，直至加滿，避免震動(dòng)
24． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心110分鐘，速度為285000g
25． 小心取出超速離心管
26． 小心收集裂解液和低密液交界面和低密液和中密液交界面的內(nèi)吞體樣品帶到6毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得富集內(nèi)吞體樣品
27． 加入xx至xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
28． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心50分鐘，速度為285000g
29． 小心抽去上清液
30． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻沉淀物
31． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
32． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存
 
 
二、 細(xì)胞樣品處理
 
1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
10． 小心抽去上清液
11． 加入xx毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
12． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入預(yù)冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
16． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
17． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)7）
18． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3800g
20． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
21． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為4300g
22． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為30000g
24． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
25． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為285000g
26． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)吞體組分
27． 加入xx毫升HEPENGBIO高密液（Reagent C），充分混勻沉淀物
28． 轉(zhuǎn)移到14毫升超速離心管
29． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO中密液（Reagent D）在HEPENGBIO高密液（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
30． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO低密液（Reagent E）在HEPENGBIO中密液（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
31． 輕輕加入xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）在HEPENGBIO低密液（Reagent E）的上面，直至加滿，避免震動(dòng)
32． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心110分鐘，速度為285000g
33． 小心取出超速離心管 
34． 小心收集裂解液和低密液交界面和低密液和中密液交界面的內(nèi)吞體樣品帶到6毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得富集內(nèi)吞體樣品
35． 加入xx至xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
36． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心50分鐘，速度為285000g
37． 小心抽去上清液
38． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻沉淀物
39． 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
40． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存