肌肉組織細(xì)胞中含有氧化酶，包括細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶和NADH四氮唑蘭還原酶（NADH-TR）等，通過組織化學(xué)染色，可以呈現(xiàn)低含量（陰性染色）和高含量（深度染色）線粒體狀況，由此分辨肌纖維類型和識別線粒體肌?。╩yopathy）。細(xì)胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸鏈的酶部分的總稱。其存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是人工電子供體染料，通過與金屬蛋白，例如含鐵蛋白細(xì)胞色素C中的物理性結(jié)合，產(chǎn)生非酶源性自然氧化，同時提供電子（細(xì)胞色素C作為電子受體）于呼吸鏈的電子傳遞系統(tǒng)，由此呈現(xiàn)出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。在DAB自然氧化的同時，產(chǎn)生活性氧，例如過氧化氫，由過氧化氫酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通過細(xì)胞色素氧化酶的作用，亞鐵細(xì)胞色素C被氧化成正鐵細(xì)胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性產(chǎn)物被用于檢測組織細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶的活性。琥珀酸脫氫酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細(xì)胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細(xì)胞呼吸鏈。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子?；阽晁崦摎涿傅姆磻?yīng)原理，使用人工電子受體染料硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的電子，而被還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)色或藍(lán)黑色甲暨色素。使用雙酶染色，可以有效地篩選線粒體疾病和進(jìn)行肌纖維分型。 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  XX毫升
HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）  XX毫升
HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）  XX管
HEPENGBIO反應(yīng)液A（Reagent C）  XX微升
HEPENGBIO染色液B（Reagent D）  XX毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液B（Reagent E）  XX微升
HEPENGBIO固著液（Reagent F）  XX毫升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO染色液A和B（Reagent B和D）和HEPENGBIO反應(yīng)液A和B（Reagent C和E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
中性樹脂：用于切片封片
光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取XX毫升HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）到XX管HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）里，混勻，標(biāo)記為HEPENGBIO染色工作液，置于冰槽里備用，避免光照（注意：有效期1周）；繼續(xù)移取XX微升HEPENGBIO染色工作液到新的1.5毫升離心管，加入100微升HEPENGBIO反應(yīng)液A（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO反應(yīng)工作液A，置于冰槽里，避免光照；同時移取XX微升HEPENGBIO染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入XX微升HEPENGBIO反應(yīng)液B（Reagent E），混勻后，標(biāo)記為HEPENGBIO反應(yīng)工作液B，置于冰槽里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
 
1． 取出待測的10微米厚的冰凍組織切片 
2． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個樣品表面
3． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
4． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反應(yīng)工作液A，鋪滿整個切片樣品表面
5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照
6． 小心移去切片上的HEPENGBIO反應(yīng)工作液A
7． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
9． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7至8二次
10． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反應(yīng)工作液B，鋪滿整個切片樣品表面
11． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
12． 小心移去切片上的HEPENGBIO反應(yīng)工作液B
13． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
14． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
15． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟13至14二次
16． 小心加上XX微升HEPENGBIO固著液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
17． 室溫下孵育15分鐘
18． 小心移去切片上的HEPENGBIO固著液（Reagent F）
19． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面
20． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
21． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟19至20二次
22． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）
23． 即刻在光學(xué)顯微鏡下觀察和計數(shù)：
單純表達(dá)細(xì)胞色素氧化酶活性的組織細(xì)胞，呈現(xiàn)棕色
單純表達(dá)琥珀酸脫氫酶活性的組織細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)色
同時表達(dá)細(xì)胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶活性的組織細(xì)胞，呈現(xiàn)棕藍(lán)色
 

肌纖維類型	COX染色	SDH染色	COX/SDH
Ⅰ	深棕色	深藍(lán)色	深棕藍(lán)色
ⅡA	中度棕色	中度藍(lán)色	中度棕藍(lán)色
ⅡB	淺棕色	淺藍(lán)色	淺棕藍(lán)色

 

狀況	COX染色	SDH染色	COX/SDH
正常	棕色	藍(lán)色	棕藍(lán)色
異常	無色	無色	單棕色或單藍(lán)色或全無色

 
注意事項
 
1． 本產(chǎn)品為20次操作
2． 建議使用異戊烷（isopentane）快速冷凍組織，避免切片冰晶形成
3． 冰凍切片不宜固定和包埋處理
4． 操作時，須戴手套
5． HEPENGBIO染色液和HEPENGBIO反應(yīng)液避免反復(fù)凍融
6． HEPENGBIO染色工作液不宜久存，1周內(nèi)使用為佳
7． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干
8． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面
9． 整個操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行
10． 染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察 
11． 樣品染色后保存，避免光照
12． 細(xì)胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶雙酶雙酶染色參考圖像： 
13． 本公司提供系列組織細(xì)胞酶活性染色試劑產(chǎn)品