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糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負(fù)電荷性長鏈多聚糖，由重復(fù)的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價(jià)相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發(fā)生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發(fā)揮各種不同的作用，包括酶的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應(yīng)?；谔前范嗵堑母叨蓉?fù)電荷的特點(diǎn)，使用異染性（metachromatic）陽離子藍(lán)色染料二甲基亞甲基藍(lán)（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結(jié)合產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復(fù)合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測定，來定量分析糖胺多糖的總含量。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO解離液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應(yīng)
微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品預(yù)處理
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定200毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個1.5毫升離心管
8． 加入xx微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B）
9． 強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻
10． 放進(jìn)56℃恒溫水槽孵育16小時
11． 放進(jìn)90℃恒溫水槽孵育10分鐘
12． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
14． 置于冰槽里備用
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
1． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
2． 分別加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1至5號管
3． 移取xx微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻
4． 小心移取xx微升1號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻
5． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻
6． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻
7． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
1． 移取xx微升上述配制的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1.5毫升離心管
2． 加入xx毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
5． 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）
7． 加入xx毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)
12． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至11四次
13． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量（微克）
四、 樣品測定
1． 加入50微升上述制備的待測樣品到1.5毫升離心管
2． 加入xx毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
5． 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）
7． 加入xx毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)
12． 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)糖胺多糖含量（微克）
五、 濃度計(jì)算
根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品對應(yīng)糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升
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糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又稱為粘多糖（mucopolysaccharide），是體內(nèi)最為豐富的異源多聚糖。糖胺多糖是一種未分叉的負(fù)電荷性長鏈多聚糖，由重復(fù)的二糖單位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronic acid），鏈接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖與核心蛋白（core protein）共價(jià)相聯(lián)，構(gòu)成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成為細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成過程中發(fā)生硫酸酯化（sulfated group），其部位在O或N位上，有利于發(fā)揮各種不同的作用，包括酶的調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、生長、遷移、分化，以及組織損傷反應(yīng)?；谔前范嗵堑母叨蓉?fù)電荷的特點(diǎn)，使用異染性（metachromatic）陽離子藍(lán)色染料二甲基亞甲基藍(lán)（1,9-dimethylmethylene blue；DMMB），在酸性條件下，特異性的結(jié)合產(chǎn)生不溶性紫色或粉紅色糖胺多糖染料復(fù)合物（Dye-GAG complex），在丙醇解離溶液中，釋放出染料，通過分光光度儀（656nm波長）測定，來定量分析糖胺多糖的總含量。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO解離液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO萃取液（Reagent B）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
恒溫水槽或干式恒溫儀：用于樣品反應(yīng)
微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品預(yù)處理
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定200毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個1.5毫升離心管
8． 加入xx微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B）
9． 強(qiáng)力渦旋震蕩1分鐘，充分混勻
10． 放進(jìn)56℃恒溫水槽孵育16小時
11． 放進(jìn)90℃恒溫水槽孵育10分鐘
12． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
14． 置于冰槽里備用
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
1． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
2． 分別加入xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到1至5號管
3． 移取xx微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻
4． 小心移取xx微升1號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻
5． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻
6． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻
7． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
| 管號 | HEPENGBIO清理液（Reagent A） | HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） | 標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量 |
| 1 | xx微升 | xx微升 | xx微克 |
| 2 | xx微升 | xx微升1號管 | xx微克 |
| 3 | xx微升 | xx微升2號管 | xx微克 |
| 4 | xx微升 | xx微升3號管 | xx微克 |
| 5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
1． 移取xx微升上述配制的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1.5毫升離心管
2． 加入xx毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
5． 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）
7． 加入xx毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光讀數(shù)
12． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至11四次
13． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)糖胺多糖含量（微克）
四、 樣品測定
1． 加入50微升上述制備的待測樣品到1.5毫升離心管
2． 加入xx毫升HEPENGBIO染色液（Reagent C）
3． 渦旋震蕩15秒
4． 室溫下孵育30分鐘，避免光照，期間每隔5分鐘渦旋震蕩15秒（注意：可見紫色或粉紅色沉淀）
5． 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g
6． 小心抽去上清液（注意：確保沒有水滴殘留）
7． 加入xx毫升HEPENGBIO解離液（Reagent D）
8． 渦旋震蕩15秒
9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照（注意：確保充分溶解）
10． 轉(zhuǎn)移到新的比色皿
11． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測（波長656nm）：獲得樣品吸光讀數(shù)
12． 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)糖胺多糖含量（微克）
五、 濃度計(jì)算
根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品對應(yīng)糖胺多糖含量（微克）÷0.050（樣品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升
