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蒂姆硫化法銀染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于觀察腦組織和其它組織中（例如胰腺、小腸、睪丸、腎臟等）微量金屬元素鋅，以及其它重金屬元素，例如銅、鎳、鈷和鐵等的染色。主要用于觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含鋅神經(jīng)元，以及新軸突分枝（sprouted axon）和軸突終端（axon terminal）等結(jié)構(gòu)，分析大腦灰質(zhì)內(nèi)部的海馬中軸突終端（突觸泡囊synaptic vesicle）、苔蘚終端（齒狀顆粒細(xì)胞dentate granule cells）中的反應(yīng)性鋅的分布，與突觸活性和膜去極化的關(guān)系，研究神經(jīng)退行性和癲癇病理性變化機(jī)制。其原理在于使用硫化物，與組織中的游離金屬元素反應(yīng)成為不溶性復(fù)合物沉積，進(jìn)而在還原劑的作用下，金屬硫化物催化還原離子銀為可見金屬銀沉積，呈現(xiàn)黑色，此為金屬自顯影術(shù)（autometallography，AMG）。新型蒂姆硫化法銀染（neo-TIMM）具有顯示（visualization）改善的優(yōu)點(diǎn)。
產(chǎn)品內(nèi)容
HPBIO硫化液（Reagent A） 500毫升
HPBIO固著液（Reagent B） 500毫升
HPBIO清理液（Reagent C） 100毫升
HPBIO染色液A（Reagent D） 5 毫升
HPBIO染色液B（Reagent E） 100微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月
用戶自備
PBS緩沖液：用于灌注
無離子水：用于組織清洗
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
無菌鑷子：用于轉(zhuǎn)移動(dòng)物腦組織
小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器
切片機(jī)：用于組織切片
明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片
中性樹脂：用于切片封片
光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣本固著處理
1． 常規(guī)麻醉動(dòng)物和手術(shù)（建議：使用用戶自備的4℃預(yù)冷的PBS由心臟處灌注約5至10分鐘，去除血液直至澄清，肝臟顯示灰白）
2． 使用適量的（30毫升）4℃預(yù)冷的HPBIO硫化液（Reagent A）灌注處理（建議：至少10分鐘，肝臟顯示發(fā)黑）
3． 使用適量的（30毫升）4℃預(yù)冷的HPBIO固著液（Reagent B）灌注處理
4． 即刻小心取出腦組織（組織顯示藍(lán)灰色調(diào)）
5． 小心放進(jìn)20毫升HPBIO固著液（Reagent B）里
6． 置于4℃冰箱里浸泡孵育60分鐘
7． 轉(zhuǎn)移到20毫升HPBIO硫化液（Reagent A）里
8． 置于4℃冰箱里浸泡孵育30分鐘
9． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊
10． 放進(jìn)用戶自備的無離子水清洗2分鐘
11． 用綿紙吸干組織快
12． 即刻進(jìn)行常規(guī)4℃冰箱里30%蔗糖脫水過夜和OCT處理后包埋
13． 在－20℃條件下進(jìn)行緩慢冰凍切片，為30微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上
14． 置于－20℃冰箱里保存
二、 樣本染色處理
染色開始前，取出HPBIO染色液A（Reagent D）置于室溫下預(yù)熱，然后移取1毫升HPBIO染色液A（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入15微升HPBIO染色液B（Reagent E），混勻后，標(biāo)記為HPBIO染色工作液，置于暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作
1． 取出10片待測(cè)的30微米厚的冰凍組織切片
2． 小心加上200微升HPBIO清理液（Reagent C）鋪滿整個(gè)切片樣品表面
3． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
4． 小心加上200微升HPBIO染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
5． 26℃溫度下孵育50分鐘，避免光照
6． 小心移去切片上的HPBIO染色工作液
7． 室溫下，小心將切片置入50毫升HPBIO清理液（Reagent C）中孵育10分鐘
8． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
9． （選擇步驟）進(jìn)行復(fù)染操作（建議使用HPBIO甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）復(fù)染試劑盒 或HPBIO中性紅復(fù)染試劑盒 ）
10． 透明處理
11． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）
12． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：含鋅神經(jīng)細(xì)胞體，例如錐體細(xì)胞、齒狀顆粒細(xì)胞、突觸泡囊等，呈現(xiàn)黑色（如果復(fù)染――細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，胞漿尼氏（體）物質(zhì)呈現(xiàn)粉紅至紫色）
13． 齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting）評(píng)分
14． 其它結(jié)構(gòu)區(qū)域染色評(píng)分
產(chǎn)品內(nèi)容
HPBIO硫化液（Reagent A） 500毫升
HPBIO固著液（Reagent B） 500毫升
HPBIO清理液（Reagent C） 100毫升
HPBIO染色液A（Reagent D） 5 毫升
HPBIO染色液B（Reagent E） 100微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月
用戶自備
PBS緩沖液：用于灌注
無離子水：用于組織清洗
1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器
無菌鑷子：用于轉(zhuǎn)移動(dòng)物腦組織
小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器
切片機(jī)：用于組織切片
明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片
中性樹脂：用于切片封片
光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣本固著處理
1． 常規(guī)麻醉動(dòng)物和手術(shù)（建議：使用用戶自備的4℃預(yù)冷的PBS由心臟處灌注約5至10分鐘，去除血液直至澄清，肝臟顯示灰白）
2． 使用適量的（30毫升）4℃預(yù)冷的HPBIO硫化液（Reagent A）灌注處理（建議：至少10分鐘，肝臟顯示發(fā)黑）
3． 使用適量的（30毫升）4℃預(yù)冷的HPBIO固著液（Reagent B）灌注處理
4． 即刻小心取出腦組織（組織顯示藍(lán)灰色調(diào)）
5． 小心放進(jìn)20毫升HPBIO固著液（Reagent B）里
6． 置于4℃冰箱里浸泡孵育60分鐘
7． 轉(zhuǎn)移到20毫升HPBIO硫化液（Reagent A）里
8． 置于4℃冰箱里浸泡孵育30分鐘
9． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊
10． 放進(jìn)用戶自備的無離子水清洗2分鐘
11． 用綿紙吸干組織快
12． 即刻進(jìn)行常規(guī)4℃冰箱里30%蔗糖脫水過夜和OCT處理后包埋
13． 在－20℃條件下進(jìn)行緩慢冰凍切片，為30微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上
14． 置于－20℃冰箱里保存
二、 樣本染色處理
染色開始前，取出HPBIO染色液A（Reagent D）置于室溫下預(yù)熱，然后移取1毫升HPBIO染色液A（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入15微升HPBIO染色液B（Reagent E），混勻后，標(biāo)記為HPBIO染色工作液，置于暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作
1． 取出10片待測(cè)的30微米厚的冰凍組織切片
2． 小心加上200微升HPBIO清理液（Reagent C）鋪滿整個(gè)切片樣品表面
3． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
4． 小心加上200微升HPBIO染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
5． 26℃溫度下孵育50分鐘，避免光照
6． 小心移去切片上的HPBIO染色工作液
7． 室溫下，小心將切片置入50毫升HPBIO清理液（Reagent C）中孵育10分鐘
8． 小心移去切片上的HPBIO清理液（Reagent C）
9． （選擇步驟）進(jìn)行復(fù)染操作（建議使用HPBIO甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）復(fù)染試劑盒 或HPBIO中性紅復(fù)染試劑盒 ）
10． 透明處理
11． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）
12． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：含鋅神經(jīng)細(xì)胞體，例如錐體細(xì)胞、齒狀顆粒細(xì)胞、突觸泡囊等，呈現(xiàn)黑色（如果復(fù)染――細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，胞漿尼氏（體）物質(zhì)呈現(xiàn)粉紅至紫色）
13． 齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting）評(píng)分
| 評(píng)分 | 特征 |
| 0 | 未見顆粒 |
| 1 | 偶見顆粒 |
| 2 | 較多顆粒，不連續(xù)分布 |
| 3 | 較多顆粒 |
| 4 | 較多顆粒，連續(xù)分布 |
| 5 | 顆粒致密成層狀帶 |
14． 其它結(jié)構(gòu)區(qū)域染色評(píng)分
| 評(píng)分 | 特征 |
| 0 | 染色陰性 |
| 1 | 染色很淺 |
| 2 | 染色較淺 |
| 3 | 中等染色 |
| 4 | 致密較深染色 |
