在基因的啟動子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“”的區(qū)域，稱為“島”（ island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近 3 萬個島。這些島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是 DNA 甲基化的位置。島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 擴(kuò)增液（Reagent A） 微升
HEPENGBIO 補(bǔ)充液（Reagent B） 毫升
產(chǎn)品說明書 1 份
 

保存方式

 
保存在－20℃冰箱里；有效保證 6 月
 

用戶自備

 
轉(zhuǎn)化樣品：經(jīng)過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的目標(biāo) DNA 分子特異引物：用于甲基化基因擴(kuò)增的引導(dǎo) DNA 分子PCR 儀：用于樣品擴(kuò)增
PCR 管或平板：用于 PCR 反應(yīng)的容器
 

實驗步驟

 
實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：
 
1. 針對一個樣本，每次移出 xx 微升 HEPENGBIO 擴(kuò)增液（Reagent A）到PCR 管
2. 加入 1 微升用戶自備的的轉(zhuǎn)化或野生型 DNA 樣品（總量 100 納克）
3. 分別加入 1 微升用戶自備的甲基化特異性的引物 F 和引物 R（各 350 納克或 25 微摩爾）

4. 再加入 xx 微升 HEPENGBIO 補(bǔ)充液（Reagent B）（反應(yīng)總量為 25 微升）
5. 即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心 5 秒，速度為 500g（或 2000RPM；例如 eppendorf 5415）
6. 加入 50 微升 PCR 級礦物油（注意：參見注意事項10）
7. 即刻進(jìn)行熱啟動 PCR 反應(yīng)：
 

溫度（℃）	時間	循環(huán)
95	9 分鐘	1
95	30 秒
Tm	30 秒	35
72	30 秒
72	5 分鐘	1

 
8. 反應(yīng)完畢后，移取 5 微升進(jìn)行 1.8%瓊脂糖凝膠電泳或 15%聚丙烯酰胺凝膠
9. 如果進(jìn)行測序鑒定，膠回收 PCR 產(chǎn)物（建議使用 HEPENGBIO 高質(zhì)純化一步法膠回收試劑盒；
HEPENGBIO20051.1）
10. 分別移出 2 微升反應(yīng)液到 2 個不同的新的 1.5 毫升離心管（每微升 100 納克）
11. 加入 1 微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物 F（每微升 350 納克）到其中一個 1.5 毫升離心管，作好標(biāo)記
12. 加入 1 微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物 R（每微升 350 納克）到另一個 1.5 毫升離心管，作好標(biāo)記
13. 進(jìn)行后續(xù)的直接測序反應(yīng)