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多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一種鋅依賴性核酶，廣泛存在于真核細(xì)胞中。PARP家屬由18個(gè)成員，其中6個(gè)已經(jīng)被證實(shí)，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-4（VPARP）、PARP-5a/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：DNA結(jié)合、切離、自修飾（automodification）、催化等結(jié)構(gòu)域。其功能在于特異性地識(shí)別DNA損傷產(chǎn)生的單鏈或雙鏈DNA斷裂，并與之結(jié)合而激活，催化將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化成煙酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合體（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反應(yīng)，由此引導(dǎo)各種DNA修復(fù)蛋白聚集到損傷部位，實(shí)施修復(fù)，同時(shí)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成（chromatin structure formation）、 細(xì)胞分化、繁殖、發(fā)育、凋亡、基因表達(dá)等，以及對于心腦缺血的反應(yīng)和腫瘤惡變的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中風(fēng)、敗血癥等引起的組織損害?；谌斯ず铣傻孜顰DP核糖對硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在損傷的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，釋放出顯色產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol），通過分光光度儀檢測吸光讀數(shù)的變化（405nm 波長），來定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入預(yù)冷的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
12． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準(zhǔn)備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長405nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入5微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品活性
六、 酶標(biāo)板測定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
5． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）或待測樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
6． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
7． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù)
9． 活性計(jì)算：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入預(yù)冷的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11． 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
12． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準(zhǔn)備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長405nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景讀數(shù)
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 加入5微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 上下傾倒數(shù)次，混勻
6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品活性
六、 酶標(biāo)板測定
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
5． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）或待測樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
6． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
7． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)
8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù)
9． 活性計(jì)算：
