鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。Fluo-4，一種與鈣離子結(jié)合，其熒光強度迅速增強100倍的熒光探針，可以敏感測定微量游離鈣離子水平。在熒光分光光度儀下，激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm，來定量測定植物組織細胞的鈣濃度。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）      毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）      毫升
HEPENGBIO飽和液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）      毫升
產(chǎn)品說明書    1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
DOUNCE勻漿器：用于組織勻化
微型臺式離心機：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
黑色96孔板：用于樣品熒光測定的容器
熒光酶標儀：用于樣品熒光分析
 
實驗步驟
 
一、 樣品準備
 
1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12． 即刻移入到1.5毫升離心管
13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－）
14． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
 
二、 測定準備
 
1． 準備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用
2． 設(shè)定好熒光酶標儀（22℃）：激發(fā)波長485nm，散發(fā)波長520nm
 
三、熒光測定
 
1． 準備1個黑色96孔板，標記為：樣品孔、空白對照孔、最大對照空
2． 移取100微升（20微克蛋白）上述制備的樣品到樣品孔里
3． 移取xx微升HEPENGBIO飽和液（Reagent D）到最大對照空里
4． 移取xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）到空白對照空
5． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent C）到所有孔里
6． 輕輕搖動黑色96孔板，混勻
7． 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
8． 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
9． 計算樣品鈣離子濃度（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數(shù)）
 
【（樣品RFU－空白對照孔RFU）÷（最大對照空RFU－樣品RFU）】X 345 （納摩爾；解離常數(shù)）