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脂類物質(zhì)（LIPIDS）是一類脂溶性（疏水性）的自然分子，分為簡單脂質(zhì)包括脂肪酸（FATTY ACID）及其衍生物甘油一脂、二脂、三脂；復(fù)合脂質(zhì)包括磷脂、糖脂、硫脂以及脂蛋白；和中性脂質(zhì)包括甘油、固醇類（STEROL）物質(zhì)，例如膽固醇。脂類物質(zhì)在機(jī)體中具有能量儲(chǔ)存的作用，是膜結(jié)構(gòu)的組成成分和細(xì)胞信號(hào)分子。尼羅紅染色劑（9-diethylamino-5H-benzo[alpha]-phenoxazine-5-one；Nile red）是一種親脂性的惡嗪類熒光染料。與極性脂類物質(zhì)，例如磷脂結(jié)合后，在特定激發(fā)波長543nm的激發(fā)下，顯示強(qiáng)烈桔紅色熒光（散發(fā)波長598nm）。其分子式為C20H18N2O2，分子量為318。由于組織切片在包埋前處理和染色前脫蠟的過程中，有機(jī)溶劑容易破壞和減少組織中的脂質(zhì)成分，因此防護(hù)和固定組織中的脂質(zhì)成分是尼羅紅染色的關(guān)鍵。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO固著液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO乳化液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO氧化液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO修復(fù)液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO脫蠟液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液A（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液B（Reagent I） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液C（Reagent J） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液D（Reagent K） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent L） 微升
HEPENGBIO稀釋液（Reagent M） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO染色液（Reagent L）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
無離子水：用于清洗樣品
1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制和樣品操作的容器
無菌手術(shù)刀和鑷子：用于組織塊處理
恒溫培養(yǎng)箱：用于組織處理孵育
6孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于組織處理的容器
小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器
切片機(jī)：用于組織切片
明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片
熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞染色后觀察分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣本固著處理
1． 用無菌手術(shù)刀將新鮮組織切成2毫米厚的組織塊
2． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進(jìn)xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）中浸泡3秒2次
3． 轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO固著液（Reagent B）里
4． 室溫下浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
5． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進(jìn)上述xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）中浸泡1小時(shí)
6． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO乳化液（Reagent C）里（注意：如果組織已經(jīng)使用福爾馬林固定的，則從這一步驟開始）
7． 在56℃恒溫培養(yǎng)箱里浸泡孵育48小時(shí)，避免光照
8． 準(zhǔn)備1個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入xx毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent D）到3個(gè)孔里
9． 再分別加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到另外3個(gè)孔里
10． 小心轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第一個(gè)孔里
11． 室溫下孵育1小時(shí)
12． 轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第二個(gè)孔里
13． 室溫下孵育1小時(shí)
14． 依次直到第六個(gè)孔
15． 小心轉(zhuǎn)移組織塊到新鮮的xx毫升HEPENGBIO氧化液（Reagent E）里
16． 在4℃冰箱里浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
17． 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
18． 室溫下孵育24小時(shí)
19． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO修復(fù)液（Reagent F）里
20． 室溫下浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
21． 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
22． 室溫下孵育8小時(shí)（注意：可以孵育24小時(shí)）
23． 用綿紙吸干組織快
24． 即刻進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋過程的基本操作（包括脫水、浸蠟、包埋等）
25． 取出組織塊，進(jìn)行緩慢石蠟切片，為10微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上
二、 脫蠟處理
1． 取出10片待測的5微米厚的石蠟包埋的組織切片
2． （選擇步驟）放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘
3． （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘
4． 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育
5． 小心移去切片上的HEPENGBIO補(bǔ)水液D（Reagent K）
6． 小心加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
7． 室溫下孵育5分鐘
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
三、 樣本染色處理
實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的HEPENGBIO染色液（Reagent L）凍融，然后移出xx毫升HEPENGBIO稀釋液（Reagent M）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent L），混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為HEPENGBIO染色工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
1． 小心加上xx微升HEPENGBIO染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
2． 室溫下孵育10分鐘，避免光照
3． 放上蓋玻片
4． 即刻在熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)波長543nnm，散發(fā)波長598nm（磷脂類物質(zhì)呈現(xiàn)桔紅色）
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO固著液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO乳化液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO氧化液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO修復(fù)液（Reagent F） 毫升
HEPENGBIO脫蠟液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液A（Reagent H） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液B（Reagent I） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液C（Reagent J） 毫升
HEPENGBIO補(bǔ)水液D（Reagent K） 毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent L） 微升
HEPENGBIO稀釋液（Reagent M） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO染色液（Reagent L）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
無離子水：用于清洗樣品
1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制和樣品操作的容器
無菌手術(shù)刀和鑷子：用于組織塊處理
恒溫培養(yǎng)箱：用于組織處理孵育
6孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于組織處理的容器
小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器
切片機(jī)：用于組織切片
明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片
熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞染色后觀察分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣本固著處理
1． 用無菌手術(shù)刀將新鮮組織切成2毫米厚的組織塊
2． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進(jìn)xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）中浸泡3秒2次
3． 轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO固著液（Reagent B）里
4． 室溫下浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
5． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊，小心放進(jìn)上述xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）中浸泡1小時(shí)
6． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO乳化液（Reagent C）里（注意：如果組織已經(jīng)使用福爾馬林固定的，則從這一步驟開始）
7． 在56℃恒溫培養(yǎng)箱里浸泡孵育48小時(shí)，避免光照
8． 準(zhǔn)備1個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入xx毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent D）到3個(gè)孔里
9． 再分別加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）到另外3個(gè)孔里
10． 小心轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第一個(gè)孔里
11． 室溫下孵育1小時(shí)
12． 轉(zhuǎn)移組織塊到上述6孔板的第二個(gè)孔里
13． 室溫下孵育1小時(shí)
14． 依次直到第六個(gè)孔
15． 小心轉(zhuǎn)移組織塊到新鮮的xx毫升HEPENGBIO氧化液（Reagent E）里
16． 在4℃冰箱里浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
17． 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
18． 室溫下孵育24小時(shí)
19． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升HEPENGBIO修復(fù)液（Reagent F）里
20． 室溫下浸泡孵育24小時(shí)，避免光照
21． 小心轉(zhuǎn)移到20毫升用戶自備的無離子水里
22． 室溫下孵育8小時(shí)（注意：可以孵育24小時(shí)）
23． 用綿紙吸干組織快
24． 即刻進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋過程的基本操作（包括脫水、浸蠟、包埋等）
25． 取出組織塊，進(jìn)行緩慢石蠟切片，為10微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上
二、 脫蠟處理
1． 取出10片待測的5微米厚的石蠟包埋的組織切片
2． （選擇步驟）放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘
3． （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘
4． 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育
| 染色缸 | 孵育時(shí)間 |
| xx毫升HEPENGBIO脫蠟液（Reagent G） | 15分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO脫蠟液（Reagent G） | 15分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO脫蠟液（Reagent G） | 15分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO補(bǔ)水液A（Reagent H） | 3分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO補(bǔ)水液B（Reagent I） | 3分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO補(bǔ)水液C（Reagent J） | 3分鐘 |
| xx毫升HEPENGBIO補(bǔ)水液D（Reagent K） | 3分鐘 |
5． 小心移去切片上的HEPENGBIO補(bǔ)水液D（Reagent K）
6． 小心加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
7． 室溫下孵育5分鐘
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
三、 樣本染色處理
實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的HEPENGBIO染色液（Reagent L）凍融，然后移出xx毫升HEPENGBIO稀釋液（Reagent M）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO染色液（Reagent L），混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為HEPENGBIO染色工作液，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
1． 小心加上xx微升HEPENGBIO染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
2． 室溫下孵育10分鐘，避免光照
3． 放上蓋玻片
4． 即刻在熒光顯微鏡下觀察：激發(fā)波長543nnm，散發(fā)波長598nm（磷脂類物質(zhì)呈現(xiàn)桔紅色）
