氫 ATP 酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位 ATP 酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導(dǎo)過程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type 或 P 型）、真細(xì)菌型

（eubacterial type 或 F 型）和囊/液泡型（vacuolar type 或 V 型）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約 100kd 蛋白；真細(xì)菌型存在于葉綠體、線粒體和細(xì)菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡型存在于真核生物細(xì)胞器的囊泡系統(tǒng)。其中植物質(zhì)膜氫ATP 酶，100kd 分子量，是植物細(xì)胞膜上重要的功能酶，為植物生命活動(dòng)的主要酶之一。氫ATP 酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機(jī)磷。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。同時(shí)利用細(xì)胞內(nèi) ATP 釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，產(chǎn)生并保持細(xì)胞膜或細(xì)胞器兩側(cè)氫離子的電化學(xué)梯度，為一系列次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道蛋白對(duì)各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。植物氫 ATP 酶還參與細(xì)胞內(nèi) pH 水平、細(xì)胞伸長、氣孔開閉、以及植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過程的調(diào)節(jié)?；诘孜?ATP，在 V 型氫ATP 酶敏感性抑制劑巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）存在與否的情況下，受到V 型氫 ATP 酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶
（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸
（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析 V 型氫 ATP 酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 

產(chǎn)品內(nèi)容

 
HEPENGBIO 清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO 酶促液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO 底物液（Reagent F） 毫升

HEPENGBIO 陰性液（Reagent G） 毫升
HEPENGBIO 專性液（Reagent H） 微升
產(chǎn)品說明書 1 份
 

保存方式

 
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO 底物液（Reagent F），避免光照，有效保證 6 月
 

用戶自備

 
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
DOUNCE 勻漿器：用于組織勻化微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光度分析的容器分光光度儀：用于光度分析
 

實(shí)驗(yàn)步驟

 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO 底物液（Reagent F） 注意避光；HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。
 

一、 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）

 
 
1. 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量
2. （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
3. （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 3 毫升）HEPENGBIO 清理液（Reagent A）清洗 1 次
4. 即刻用刀片切碎組織
5. 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
6. 加入預(yù)冷的 xx 毫升 HEPENGBIO 裂解液（Reagent B）
7. 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻
8. 即刻放進(jìn)預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約 80 下）
9. 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 5000g（或7500RPM，例如 eppendorf 5415）
10. 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)?，重?fù)離心 5 分鐘一次，速度為 5000g（或 7500RPM， 例如 eppendorf 5415）
12. 即刻移入到 1.5 毫升離心管
13. 移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
HEPENGBIO30030.1）
14. 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用二、測(cè)定準(zhǔn)備

 
1. 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如植物組織細(xì)胞裂解樣品等），置于冰槽里
2. 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 28℃）：波長為 340nm，間隔 5 分鐘，讀數(shù) 7 次（共 30 分鐘），并置零三、 背景對(duì)照測(cè)定
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
5. 放進(jìn) 28℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
6. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 陰性液（Reagent G）
7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 10 分鐘或 30 分鐘
 

四、 樣品總活性測(cè)定

 
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
5. 放進(jìn) 28℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
6. 加入 50 微升待測(cè)樣品（注意：100 微克總蛋白）
7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 10 分鐘或 30 分鐘
 

五、 樣品非特異活性測(cè)定

 
實(shí)驗(yàn)開始前，移取 50 微升待測(cè)樣品（注意：100 微克總蛋白）到 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 HEPENGBIO 專性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混勻后，放進(jìn) 28℃培養(yǎng)箱里孵育 15 分鐘。然后置于冰槽里備用
 
1. 移取 xx 微升 HEPENGBIO 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 酶促液（Reagent D）
3. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液（Reagent E）
4. 加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent F）
5. 放進(jìn) 28℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘
6. 加入 60 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
8. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 10 分鐘或 30 分鐘
 
 

五、 計(jì)算樣品活性