氫ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type或P型）、真細(xì)菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約100kd蛋白；真細(xì)菌型存在于葉綠體、線粒體和細(xì)菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡型存在于真核生物細(xì)胞器的囊泡系統(tǒng)。其中植物質(zhì)膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細(xì)胞膜上重要的功能酶，為植物生命活動(dòng)的主要酶之一。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無(wú)機(jī)磷。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。同時(shí)利用細(xì)胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，產(chǎn)生并保持細(xì)胞膜或細(xì)胞器兩側(cè)氫離子的電化學(xué)梯度，為一系列次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道蛋白對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。植物氫ATP酶還參與細(xì)胞內(nèi)pH水平、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔開閉、以及植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。基于底物ATP，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）和氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾下，在P型氫ATP酶敏感性抑制劑原釩酸鹽（orthovanadate）存在與否的情況下，受到P型氫ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析P型氫ATP酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）  毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）       毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）  毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D）       毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）       毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G）    毫升
HEPENGBIO專性液（Reagent H）      微升
產(chǎn)品說(shuō)明書      1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
DOUNCE勻漿器：用于組織勻化
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度儀：用于光度分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent F）注意避光；HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）
 
1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量 
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要3毫升）HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
12． 即刻移入到1.5毫升離心管
13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
14． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
 
二、測(cè)定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如植物組織細(xì)胞裂解樣品等），置于冰槽里 
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為28℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零
 
三、 背景對(duì)照測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent G）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘或30分鐘
 
四、 樣品總活性測(cè)定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6． 加入50微升待測(cè)樣品（注意：100微克總蛋白）
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘或30分鐘
 
五、 樣品非特異活性測(cè)定
 
實(shí)驗(yàn)開始前，移取50微升待測(cè)樣品（注意：100微克總蛋白）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混勻后，放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
6． 加入60微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)10分鐘或30分鐘
 
五、 計(jì)算樣品活性
 
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
 
 
2）樣品特異活性