人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個(gè)蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細(xì)胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD⁺輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴氨酸脫乙?；福╨ysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙?；磻?yīng)，以及由NAD⁺和乙酰（acetyl）基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，與酵母Sir2同源性最高。其功能在于調(diào)節(jié)p53活性和抑制細(xì)胞凋亡?；谌斯ず铣傻囊阴；痯53（379至382氨基酸位點(diǎn)）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用比色染料對(duì)硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）來標(biāo)記乙?；痯53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；詈蟮孜镞M(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對(duì)硝基苯胺（波長405nm），由此來定量測定沉默調(diào)節(jié)蛋白1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO分離液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO清理液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent E）     毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）     微升
HEPENGBIO終止液（Reagent G）     微升
HEPENGBIO酶解液（Reagent H）     微升
HEPENGBIO補(bǔ)充液（Reagent I）     微升
產(chǎn)品說明書    1份
保存方式
 
保存HEPENGBIO緩沖液（Reagent E）、HEPENGBIO底物液（Reagent F）、HEPENGBIO終止液（Reagent G）和HEPENGBIO酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗組織樣品
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于組織細(xì)胞預(yù)處理
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
酶標(biāo)板或比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器
酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
 
一、樣品準(zhǔn)備
 
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗1次
4． 移入到一個(gè)液氮凍存管
5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8． 加入xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），混勻細(xì)胞
9． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管 
10． 強(qiáng)力渦旋震蕩10秒
11． 置于冰槽里孵育15分鐘
12． 加入xx毫升預(yù)冷的HEPENGBIO分離液（Reagent B），混勻
13． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
14． 小心抽去上清液
15． 加入xx毫升預(yù)冷的HEPENGBIO清理液（Reagent C）
16． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g
17． 小心抽去上清液
18． 小心加入xx微升預(yù)冷的HEPENGBIO萃取液（Reagent D），混勻
19． 轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
20． 超聲處理30秒
21． 置于冰槽里孵育30分鐘
22． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
23． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
24． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ ）
25． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測定準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為30℃）： 波長405nm，并置零 
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度
 
三、活性測定
 
（一） 終點(diǎn)法活性測定
 
1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO補(bǔ)充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克組織裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
6． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育60分鐘，避免光照
7． 分別加入xx微升HEPENGBIO終止液（Reagent G）
8． 分別加入xx微升HEPENGBIO酶解液（Reagent H）
9． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
10． 在30℃培養(yǎng)箱里，孵育30分鐘
11． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：獲得吸光讀數(shù)
12． 活性計(jì)算：
 
（1） 酶標(biāo)儀檢測
 
 
 
（2） 比色皿檢測
 
 
 
（二） 酶動(dòng)法活性測定
 
1. 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測樣品
1． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent E）到相應(yīng)孔中
2． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO補(bǔ)充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克組織裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
4． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30秒
5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育2分鐘，避免光照
6． 分別加入xx微升HEPENGBIO酶解液（Reagent H）
7． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板5秒
8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測：間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）――獲得吸光讀數(shù)
9． 活性計(jì)算：
 
（1） 酶標(biāo)儀檢測
 
 
（2） 比色皿檢測