超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM-H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種完全自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定線粒體活性氧族的濃度。
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）      3毫升
HEPENGBIO補(bǔ)充液（Reagent B）      3毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）     40微升
產(chǎn)品說明書 1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO染色液（Reagent C），嚴(yán)格避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
黑色96孔板：用于樣品操作的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光線粒體
熒光酶標(biāo)儀：用于測(cè)定線粒體熒光強(qiáng)度
 
實(shí)驗(yàn)步驟
 
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑放進(jìn)冰槽里融化，避免光照；同時(shí)從－80℃冰箱里取出待測(cè)的線粒體，放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，標(biāo)記好背景對(duì)照孔和待測(cè)樣品孔
2． 分別加入150微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）
3． 移取50微升線粒體懸液（總量為50微克線粒體蛋白）到黑色96孔板的相應(yīng)待測(cè)樣品孔里
4． 加入50微升HEPENGBIO補(bǔ)充液（Reagent B）到黑色96孔板的相應(yīng)背景對(duì)照孔里
5． 分別加入2微升HEPENGBIO染色液（Reagent C）到上述孔里
6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
7． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
a) 使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：
1）移取10微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――
綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高
 
b) 或使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：
1）直接放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――
樣品RFU－對(duì)照RFU＝實(shí)際線粒體RFU：增高，表明活性氧族（ROS）含量高