糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK；EC 2.7.11.26）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其目標(biāo)蛋白為糖原合成酶和活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T lymphocytes；NFAT），進(jìn)行磷酸化后，抑制其功能，同時調(diào)控細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)、生物發(fā)育的組織排列（tissue patterning）、蛋白合成、細(xì)胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3從酵母到人體高度進(jìn)化保留，果蠅中GSKΒ同源蛋白為Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信號通路中磷酸化β-catenin，導(dǎo)致后者泛素化后降解，防止β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰島素、生長因子、蛋白激酶B（protein kinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒腫瘤基因同源體（akt）調(diào)控。糖原合成酶激酶3分成兩種異構(gòu)體：糖原合成酶激酶3α和β，其結(jié)構(gòu)相似，功能不同。糖原合成酶激酶3β與tau蛋白磷酸化、能量代謝、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、機(jī)體形狀構(gòu)成等有關(guān)。糖原合成酶激酶3β功能異常將導(dǎo)致阿茲罕默綜合征等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為GPHRSTPESRAAV?；诘孜颎PHRSTPESRAAV，在ATP和GSK3α抑制劑Aloisine A的存在下，受到GSK3β激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析糖原合成酶激酶3β的特異活性。其反應(yīng)方式為：
GSK3β
GPHRSTPESRAAV  +  ATP  →  GPHRSTPEpSRAAV  +  ADP
 
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP
         
lactate dehydrogenase
pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD+
           （高吸收峰） （低吸收峰） 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A）                    120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）                     10毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）                      4毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D）                500微升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent E）                500微升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）                    500微升
HEPENGBIO陰性液（Reagent G）                500微升
產(chǎn)品說明書       1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
 
用戶自備
 
GSK3β激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離
（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析
 
實驗步驟
 
一、 待測樣品準(zhǔn)備
 
1． 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 107細(xì)胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻（注意：可以調(diào)節(jié)蛋白濃度）
10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位